摘要

近日，北京大学张文彬教授团队发展了一种新的蛋白质主动模板AT-Snoop，并将其与此前报道的主动模板AT-Spy联用，通过多组分的一步反应实现了蛋白质异质线型高阶索烃（包括[3]索烃和[5]索烃）的选择性制备。这类蛋白质的拓扑结构也通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱、质谱和酶切等实验得到了证明。该工作不仅提供了新的蛋白质改造工具，也将进一步加深对于拓扑蛋白质构效关系和功能优势的深入理解。

研究背景
高分子化学的四大挑战包括对其长度、序列、立体化学与拓扑结构的精准调控。得益于高分子化学与各种精准偶联方法的发展，各种序列准确、长度可控和立体结构精准的聚合物被合成出来。然而，高分子链构象空间庞大，同时又存在众多反应活性相近的官能团，使得合成具有精确拓扑结构的高分子尤其困难。主动模板法是一种构建机械互锁分子的强力工具，它不仅能将反应组分预组装成缠结结构，同时还通过催化共价键形成来得到特定的拓扑结构。张文彬课题组将此概念引入蛋白质领域，发展了第一例蛋白质主动模板AT-Spy。通过对来源于CnaB2结构域的SpyTag/BDTag/SpyStapler复合物进行重新接线，所得环状SpyStapler能够与N/C端分别带有BDTag/SpyTag的线型蛋白质重组并形成缠结结构，随后催化异肽键形成得到异质索烃。通过对该工具的工程化，发展了效率更高的蛋白质主动模板AT-Spy003，并将其应用于构建辐射型蛋白质[n]索烃（n=3,4,5）。为了进一步挖掘主动模板在拓扑高分子合成方面的潜力，我们需要开发更多高效且相互正交的蛋白质主动模板工具，以拓展蛋白质拓扑结构的多样性。

工作亮点
基于上述考虑，北京大学张文彬课题组通过对天然存在异肽键交联的RrgA结构域进行拆分与重新接线，得到CatTag/DogTagSr/SnoopStapler，并发展了新的主动模板工具AT-Snoop。在AT-Snoop体系里，环状的c-SnoopStapler与N端带有CatTag和C端带有DogTagSr的线型蛋白质重组形成缠结结构，随后SnoopStapler催化CatTag与DogTagSr之间异肽键的形成，得到蛋白质异质索烃。作者首先在异质[2]索烃的合成反应中验证了该设计的可行性（图1）。在二氢叶酸还原酶DHFR的两端分别融合CatTag和DogTagSr得到线型蛋白质，利用分离型内含肽的胞内环化反应得到环状催化结构域c-SnoopStapler，二者等比例混合成功制备异质索烃。值得注意的是，反应同时也给出一定比例的环状副产物c-CatTag-DHFR-DogTagSr。这可能是由于反应前尚未形成缠结结构。作者也在交叉实验中进一步验证了AT-Spy与AT-Snoop的正交反应性。这使得高阶线型索烃的简易制备成为可能（图2）。

图1 AT-Snoop与AT-Spy的反应性表征

图2 基于正交主动模板的蛋白质高阶索烃的合成方法

随后，作者利用正交的主动模板通过一锅反应制备了蛋白质异质[3]索烃（图3）。利用分离型内含肽得到带有两个不同催化结构域的c-SnoopStapler-SpyStapler，将其与两个线型蛋白质BDTag-KN035-SpyTag和CatTag-DHFR-DogTagSr按等摩尔比混合，能够高选择性得到异质[3]索烃。当AT-Snoop中的SnoopStapler为线型结构时，其与CatTag-DogTagSr线型蛋白质经由细胞内AT-Snoop反应能够得到准轮烷基元rtx-Snoop-1，准轮烷轴末端的BDTag和SpyTag能够进一步与环状蛋白质c-SpyStapler-KN035通过AT-Spy反应形成另一种异质[3]索烃。准轮烷基元能够进一步简化拓扑蛋白质的制备过程，减少所需蛋白质前体数量，有利于构建更加复杂的拓扑结构。

图3 两种蛋白质异质[3]索烃的合成与表征

基于在细胞内预先合成准轮烷反应基元的策略，作者进一步制备了对称奥林匹克环与不对称奥林匹克环（图2）。首先共表达两个线型蛋白质CatTag-DogTagSr和BDTag-SnoopStapler-SpyTag，二者经由AT-Snoop反应得到准轮烷rtx-Snoop-2。将其与两个SpyStapler的融合蛋白质按照2:1反应可得对称奥林匹克环，利用电泳洗脱可进一步提纯产物。不对称奥林匹克环的制备需要两种不同的准轮烷前体。将rtx-Snoop-1作为一个反应基元，另一个准轮烷rtx-Spy-1由BDTag-GFP-SpyTag与CatTag-SpyStapler-DogTagSr在细胞内经AT-Spy反应得到，将两者与c-SnoopStapler-SpyStapler等比例反应则可以制备不对称奥林匹克环。两种蛋白质奥林匹克环的产率相当，说明融合蛋白质的插入不影响本方法的反应效率（图4）。

图4 蛋白质奥林匹克环的合成与表征

总结与展望
综上所述，作者发展了一种与AT-Spy相互正交的蛋白质主动模板AT-Snoop，并通过这两种工具的联用实现了蛋白质异质[3]索烃和奥林匹克环的精确合成。这些高阶索烃可以在不同位置融合多种功能蛋白质，后续有望应用到流线型催化反应、配体多价展示及分子协同变构等方面。该工作不仅为蛋白质拓扑工程提供了新的合成工具，同时也为构建高度复杂的机械互锁结构开辟了新的途径，有助于未来进一步探索与运用拓扑蛋白质的独特功能优势。

该研究近期在线发表于CCS Chem.，太阳成集团tyc9728博士生张凡为该论文第一作者。太阳成集团tyc9728刘雅杰博士和达晓娣博士也为本工作做出了贡献。太阳成集团tyc9728张文彬教授为通讯作者。该工作得到国家自然科学基金、国家重点研发项目和北京分子科学国家研究中心创新项目的支持。

原文链接：https://doi.org/10.31635/ccschem.023.202303071